Biologia molekularna

obowiązkowe

Biochemia 1400-113BCH
Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Przed przystąpieniem do realizacji przedmiotu "Biologia molekularna" studenci powinni zaliczyć I rok studiów I stopnia.

w sali

Omówienie wybranych genomów i ich ewolucji. Metody sekwencjonowania genomów. Mikromatryce DNA. Replikacja DNA. Mechanizmy regulacji ekspresji genów prokariotycznych na poziomie inicjacji transkrypcji oraz post-transkrypcyjnie. Globalna regulacja ekspresji genów u bakterii (regulony, quorum sensing). Chromatyna i architektura jądra komórkowego. Regulacja transkrypcji u eukariontów. Zjawisko interferencji RNA. Mechanizmy epigenetyczne. Translacja u eukariontów. Aminokwasy i łańcuch polipeptydowy. Fałdowanie, struktura białek i modyfikacje posttranslacyjne białek.

Zajęcia laboratoryjne są podzielone na trzy bloki prowadzone przez pracowników Instytutu Biochemii, Instytutu Biologii Eksperymentalnej i Biotechnologii Roślin oraz Instytutu Mikrobiologii. Każdy blok składa się z czterech zajęć. Dotyczą metod klonowania i manipulacji DNA, izolowania białek rekombinowanych, metod biologii molekularnej roślin oraz podstawowej analizy sekwencji DNA i posługiwania się bazami danych.

Wykład

Struktura DNA. Replikacja DNA w organizmach eukariotycznych. Szczegółowe omówienie budowy i roli fragmentów Okazakich oraz problemu terminacji replikacji DNA. Rola i struktura telomerów. Rodzaje uszkodzeń DNA i mechanizmy ich naprawy. Łączenie końców niehomologicznych oraz rekombinacja homologiczna.

Narzędzia w biologii molekularnej i sekwencjonowanie DNA. Chemiczna synteza oligonukleotydów i metoda PCR. Podstawowe enzymy wykorzystywane w procedurach laboratoryjnych biologii molekularnej. Metody sekwencjonowania genomów: metoda Sangera oraz sekwencjonowanie nowej generacji. Omówienie etapów poznawania genomu człowieka. Wykorzystanie DNA do archiwizacji danych.

Struktura genomów, ich elementy i ewolucja. Pierwsze scharakteryzowane genomy i ich cechy. Przedstawienie hipotez dotyczących ewolucyjnego pochodzenia genów. Najważniejsze elementy strukturalne genów. Organizacja genomów. Elementy transpozycyjne, ich budowa oraz mechanizmy transpozycji.

Przykłady różnych mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów u organizmów prokariotycznych na poziomie inicjacji i terminacji transkrypcji (m.in. operon laktozowy, operon arabinozowy, operon tryptofanowy, atenuacja). Regulacja na poziomie (i) post-traskrypcyjnym z udziałem białek i regulatorowego RNA (m.in. ryboregulacja, ryboprzełączniki), (ii) translacji i (iii) post-translacyjnie. Pojęcie operonu, regulonu i modulonu. Globalna regulacja na poziomie komórki (m.in. dwuskładnikowy system regulacyjny) oraz całej populacji (w tym quorum sensing). Replikacja i rekombinacja u bakterii.

Regulacja ekspresji genów u eukariontów, ze szczególnym uwzględnieniem hierarchicznej organizacji chromatyny i przestrzennej architektury jądra komórkowego. Zjawisko separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) umożliwiające tworzenie kondensatów transkrypcyjnych zawierających polimerazę II RNA i czynniki regulacyjne. Transkrypcja, w tym inicjacja, elongacja i terminacja prowadzone przez polimerazę II RNA. Rola enhancerów, superenhancerów i czynników transkrypcyjnych w precyzyjnej regulacji genów. Dojrzewanie mRNA, takie jak splicing, poliadenylacja i eksport. Małe RNA (miRNA, siRNA, piRNA) i ich udział w regulacji genów oraz utrzymaniu integralności genomu.

Translacja u eukariontów. Aminokwasy. Właściwości łańcucha polipeptydowego. Struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowe białek. Fałdowanie białek. Chaperony i chaperoniny. Modyfikacje posttranslacyjne białek.

Ćwiczenia

Endonukleazy restrykcyjne i enzymy służące do modyfikacji DNA. Rekombinacja DNA, klonowanie. Metody wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii. Wektory plazmidowe. Antybiotyki stosowane w biologii molekularnej. Izolacja DNA plazmidowego, jego elektroforeza, oraz ocena czystości i jakości. Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu. Metody selekcji zrekombinowanego DNA, alfa-komplementacja. Represja kataboliczna.

Izolacja rekombinowanego białka enzymatycznego wyrażanego w komórkach bakterii E. coli, metodą chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu. Ocena jakości otrzymywanych preparatów białkowych: i) oznaczenie aktywności katalitycznej enzymu; ii) analiza czystości preparatu metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (porównanie różnych metod barwienia żeli: błękitem Coomassie R-250, srebrem i barwnikiem fluorescencyjnym); iii) identyfikacja immunologiczna metodą Western (porównanie różnych metod wizualizacji powstających kompleksów antygen - przeciwciało, zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą i peroksydazą z chrzanu oraz różnych metod detekcji, w tym wzmocnionej chemiluminescencji).

Organizmy modyfikowane genetycznie na przykładach roślin transgenicznych – sposób otrzymania i wykorzystanie. Wykonanie transformacji przejściowej roślin tytoniu przez infiltrację liści hodowlą bakterii Agrobacterium tumefaciens, niosącą konstrukt genetyczny z genem markerowym.

Na zajęciach zostaną przedstawione najczęściej stosowane w biologii geny repotrerowe, jak białko zielonej fluorescencji (GFP), lucyferaza, glukouronidaza (GUS), itp. Zostaną omówione także metody badania oddziaływań z zastosowaniem genów reporterowych, jak drożdżowy system dwuhybrydowy, FRET (Föster Resonance Energy Transfer), BiFC (Bimolecular fluorescence complementation). Podczas ćwiczeń przeprowadzone zostanie doświadczenie polegające na przejściowej transformacji roślin i obserwacji ekspresji wprowadzonego genu poprzez obserwację białka zielonej fluorescencji z zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego. Konstrukty używane podczas ćwiczeń zawierają geny kodujące fuzje translacyjne GFP z białkami występującymi w różnych częściach komórki. Pozwoli to na analizę lokalizacji tych białek. Podczas ćwiczeń zostaną także przeprowadzone obserwacje roślin wyrażających gen glukouronidazy pod kontrolą różnych specyficznych tkankowo promotorów.

Na zajęciach zostanie omówiona technika PCR w czasie rzeczywistym (RealTime PCR), zasady działania, w tym specyficzna i niespecyficzna detekcja kwasów nukleinowych oraz zagadnienia związane z planowaniem eksperymentu takie jak wybór genów referencyjnych oraz projektowanie oligonukleotydów. Przedstawione zostaną warianty metody oraz możliwe zastosowanie.

Metody biologii molekularnej stosowane w analizach mutantów oraz linii transgenicznych Arabidopsis. Genetyka roślin – podejście forward i reverse w pracy z modelową rośliną Arabidopsis thaliana, metody mutagenezy Arabidopsis, badania przesiewowe mutantów oraz mapowanie mutacji punktowych i insercyjnych (m.in. analiza PCR sekwencji polimorficznych w dwóch ekotypach Arabidopsis).

Materiały dostarczone przez zespół prowadzący.

Podstawy biologii molekularnej. L.A. Allison, Wyd. UW, 2009

Biologia molekularna. Krótkie wykłady. P. Turner i in., PWN, 2005 lub późniejsze

Techniki laboratoryjne w biologii molekularnej. A. Lewandowska-Ronnegren, MedPharm, 2017

Podstawy biologii komórki. B. Alberts i in., PWN, 2019 lub późniejsze

Biologia molekularna bakterii. J. Baj, Z. Markiewicz, PWN, 2015

Mikrobiologia. J. Baj, PWN, 2018

Biochemia. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. PWN, 2005 lub późniejsze

Biochemia Harpera, V.W. Rodwell i in., PZWL, 2004 lub późniejsze

Genomy. T.A. Brown, PWN, 2009 lub późniejsze

Genes IX. B.Lewin, Jones and Bartlett Publ., 2007 lub późniejsze

Brock Biology of Microorganisms. M.T. Madigan, J.M. Martinko

Introduction to Protein Structure. C. Branden, J. Tooze, Garland Publ., 1999 (uzup., dla zainteresowanych)

Introduction to Protein Architecture, A.M. Lesk, Oxford University Press, 2001 (uzup., dla zainteresowanych)

WIEDZA:

1. Zna i rozumie główne kategorie pojęciowe biologii molekularnej (K_W12 S1-BI;

K_W01 S1-BT)

2. Zna i rozumie molekularne podstawy funkcjonowania komórek prokariotycznych i

eukariotycznych (K_W12 S1-BI; K_W01 S1-BT)

3. Zna najważniejsze odkrycia naukowe w historii biologii molekularnej (K_W02 S1-

BT).

4. Zna i rozumie główne techniki laboratoryjne stosowane w biologii molekularnej

(K_W14 S1-BI; K_W04 S1-BT)

5. Zna i rozumie zasady BHP i zasady ergonomii, zapewniające bezpieczną pracę w

laboratorium biologii molekularnej (K_W17 S1-BI; K_W09 S1-BT)

UMIEJĘTNOŚCI

1. Potrafi stosować główne techniki i narzędzia badawcze biologii molekularnej oraz

umie wyjaśnić zasady ich działania (K_U01 S1-BI; K_U01 S1-BT)

2. Potrafi pod nadzorem opiekuna naukowego zaprojektować i przeprowadzić prosty

eksperyment z zastosowaniem poznanych metod biologii molekularnej; umie

zaproponować metody przeprowadzenia podstawowych analiz kwasów

nukleinowych i białek (K_U05 S1-BI; K_U04 S1-BT)

3. Potrafi poprawnie wnioskować na podstawie danych eksperymentalnych,

analizować otrzymane wyniki, i dyskutować je w oparciu o dostępną literaturę

(K_U03 S1-BI; K_U06 S1-BT)

4. Potrafi korzystać z dostępnych źródeł informacji oraz uczyć się samodzielnie

zagadnień wskazanych przez opiekuna (K-U09 S1-BI; K_U03 S1-BT)

KOMPETENCJE SPOŁECZNE

1. Jest gotów do zrozumienia procesów biologii molekularnej i poszerzania

zainteresowania w tym zakresie (K_K01 S1-BI; K_K01 S1-BT)

2. Jest gotów do wykazywania odpowiedzialności za własną pracę i powierzony

sprzęt w laboratorium biologii molekularnej (K_K05 S1-BI; K_K03 BT)

3. Jest gotów stosowania zasad bezpiecznego eksperymentu w laboratorium biologii

molekularnej i właściwego postępowania w stanach zagrożenia (K_K05 S1-BI;

K_K03 BT)

4. Jest gotów do efektywnej pracy w zespole (K_K07 S1-BI; K_K04 S1-BT)

Zajęcia (ćwiczenia) są zaliczane jeśli student: (i) uczestniczył w co najmniej 85% zajęć; (ii) pracował na zajęciach w sposób pozwalający pozytywnie ocenić wiedzę, umiejętności i kompetencje społeczne, jakie w toku zajęć uzyskał (opisane w sylabusie jako przedmiotowe efekty kształcenia); (iii) zaliczył pisemne kolokwium.

Szczegółowe warunki zaliczenia zajęć: (i) obecność i aktywny udział w zajęciach eksperymentalnych; (ii) wykonanie zadań zleconych do samodzielnego opracowania; (iii) zaliczenie pisemnego kolokwium (zawiera zarówno pytania testowe jak i otwarte). Czas trwania kolokwium: 90 min. Aby zaliczyć kolokwium, należy uzyskać ponad połowę możliwych do zdobycia punktów.

Warunki zaliczenia egzaminu (przedmiotu).

Warunkiem dopuszczającym do egzaminu jest zaliczenie ćwiczeń składających się na dany przedmiot. Forma egzaminu końcowego: pisemna (test pojedynczego wyboru; test wielokrotnego wyboru; pytania opisowe). Warunkiem jego zaliczenia jest uzyskanie 60% możliwych do zdobycia punktów.

Nie.